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Microscopie des objets de phase
En microscopie biologique, les objets – coupes très minces ou milieux aplatis entre deux lames – sont transparents et nécessitent un éclairage par transmission.
 Boîte de préparations microscopiques |
Ils sont visibles par leurs variations d’absorption, naturelle ou provoquée par fixation de colorants spécifiques. En microscopie métallographique, imposant un éclairage par réflexion, les surfaces, préalablement polies, sont soumises à une attaque chimique acide ou basique développant pour chacun des éléments des sels de coloration spécifiques. Dans tous ces cas, les objets, rendus visibles par leurs différences locales de facteurs de transmission ou de réflexion qu’il a fallu provoquer, constituent des objets d’amplitude. Cette coloration ou cette attaque chimique modifie la nature de l’objet ; c’est souvent un procédé destructif particulièrement regrettable en biologie. Les objets ne présentant aucune variation d’absorption ou de réflexion appartiennent à la classe des objets de phase.
 Fig. 1 |
Supposons un objet totalement transparent mais présentant dans sa structure des variations d’indice de réfraction (fig. 1a) ou un objet réfléchissant de surface non parfaitement plane (fig. 1b). Lorsqu’une onde lumineuse  traverse de tels objets ou s’y réfléchit, elle parcourt des chemins optiques (produits de l’indice de réfraction par l’épaisseur) variables, suivant un trajet plus ou moins long proportionnel à l’épaisseur e, à une vitesse inversement proportionnelle à l’indice, plus ou moins grande.
Pour mettre en évidence ces variations de phase, des techniques d’observation comme le contraste de phase et le contraste interférentiel s’imposent.
 Fig. 2 |
La méthode de contraste de phase, imaginée par Zernike, transforme les variations de phase en variations d’intensité. Supposons (fig. 2) une source ponctuelle S au foyer d’un condenseur fournissant donc une onde plane qui traverse l’objet. Si l’on admet l’objet vide, après traversée de l’objectif, cette onde, représentative du faisceau de lumière directe, converge en S' dans le plan de la pupille et éclaire uniformément le plan de l’image intermédiaire. S’il existe dans l’objet un détail déphasant B non dénué de dimension, il diffracte la lumière dans un angle d’autant plus grand qu’il est de plus faible dimension. Le faisceau de lumière diffractée s’étale dans le plan de la pupille et vient converger en B' image de B.
 Fig. 3 |
Les deux ondes, directe et diffractée, issues d’un même point source sont cohérentes entre elles et peuvent donc interférer. L’image observée en B' résulte donc des interférences entre ces deux ondes et, dans un diagramme de Fresnel, peut être représentée (fig. 3a) par un vecteur  de même norme (puisqu’il n’y a pas variation d’absorption et si l’on suppose que l’objectif recueille toute la lumière diffractée) que celle du vecteur  représentant l’onde directe, déphasé de l’angle . L’onde résultant donc des interférences entre onde directe et onde diffractée D, on vérifie .
Le vecteur  représente donc l’onde diffractée et, si le déphasage est très faible, on peut admettre que les vecteurs et , représentant respectivement les ondes directe et diffractée, sont en quadrature de phase.
 Fig. 4 |
Le contraste interférentiel, en particulier proposé par Nomarski, est basé sur l’emploi d’un interféromètre à ondes polarisées utilisant les propriétés des matériaux biréfringents, cristaux d’indice variable avec la direction. L’instrument contient (fig. 4) un biprisme de Wollaston Wi d’angle  localisé dans le plan de la pupille de l’objectif (son plan focal image). Placé entre deux polariseurs croisés orientés à 45° de ses axes, il produit deux ondes polarisées perpendiculairement d’amplitudes égales, capables d’interférer car cohérentes entre elles, décalées angulairement dans la direction perpendiculaire à l’arête du prisme de
 étant la biréfringence du cristal égale à la différence entre ses indices extraordinaire et ordinaire.
 Fig. 5 |
Pour les objets étendus de structure complexe, cette interférométrie est une méthode de visualisation très appréciée si le dédoublement est infiniment petit et en toute rigueur inférieur à la limite de résolution de l’objectif afin que le dédoublement de l’image ne soit pas visible. Pour ce dédoublement d dans la direction x (fig. 5), en tout point introduisant une variation de chemin optique  (x), la différence de marche  (x) entre les deux ondes est
où '(x) représente le gradient (la dérivée) de (x). La différence de marche mise en évidence par interférences est donc une fonction linéaire de la pente de la différence de marche introduite par l’objet. On visualise donc, non pas les variations de phase, mais celles de son gradient.
Le microscope polarisant
Ce microscope est utilisé pour l’étude des objets transparents biréfringents ou réfléchissants biabsorbants. Il offre un intérêt particulier en minéralogie, cristallographie, pétrographie, paléontologie et constitue également une source d’information en métallographie, en chimie et dans tout le secteur biomédical. Il identifie les cristaux constituant l’objet ou qui y sont inclus, l’orientation de leurs axes, les contraintes internes créant une biréfringence. Il permet la mesure de la biréfringence ou de la biabsorbance (différence entre les indices d’extinction, partie imaginaire de l’indice de réfraction), le repérage du plan de section principale, des lignes neutres, des directions d’axe, contribuant à la caractérisation du système cristallin.
 Fig. 6 |
Ce microscope, conçu comme un microscope ordinaire, est équipé d’un polariseur P et d’un analyseur tournant A, placés respectivement avant le condenseur et derrière l’objectif. Les deux polariseurs étant croisés, la lumière blanche est éteinte, sauf dans les zones biréfringentes apparaissant teintées, car chacune d’elles peut être considérée comme une lame onde (le produit de sa biréfringence et de son épaisseur étant égal à un nombre entier de longueurs d’onde), pour une longueur d’onde particulière éteinte alors que les autres composantes spectrales partiellement transmises fournissent la teinte résiduelle (teinte dite de Newton). Dans ce type d’observation, en éclairage orthoscopique ou en lumière parallèle (fig. 6a) utilisant un condenseur de faible ouverture, le microscope est analogue à un polariscope classique. L’objet biréfringent dédouble l’onde incidente et se comporte comme un interféromètre, l’interférogramme étant localisé dans le plan de l’objet. En faisant tourner l’objet dans son plan, sa teinte s’éteint quatre fois suivant deux directions perpendiculaires, déterminant ainsi son plan de section principale contenant son axe optique.
Ce type d’observation ne convient pas quand l’axe optique du cristal est parallèle au sens de propagation de la lumière. L’extinction subsiste alors, quelle que soit l’orientation de l’objet, mais la différence de marche entre les deux ondes varie avec l’incidence de la lumière. En utilisant un condenseur très ouvert, permettant (fig. 6b) d’éclairer l’objet en lumière convergente ou éclairage conoscopique, l’interférogramme résultant de la composition des deux ondes est localisé à l’infini, donc visible dans le plan de la pupille de sortie de l’objectif. On l’observe à l’aide d’une lunette constituée de l’oculaire et d’une lentille additionnnelle ou lentille de Bertrand LB interposée entre objectif et oculaire. Un trou Tc, isolant dans le plan de l’image le détail intéressant du champ, permet d’observer la figure d’axe relative à ce détail, la pupille de l’œil étant alors placée dans l’image de ce trou fournie par l’oculaire.
Microscopie en fluorescence
La fluorescence est une propriété caractéristique de nombreuses substances : excitées par un rayonnement de courte longueur d’onde (de l’ultraviolet au bleu), elles émettent un rayonnement de plus grande longueur d’onde dans le domaine visible (du vert à l’orange). Le rendement de cette transformation est très faible. Les premières expériences dues à Reichert, effectuées en fond noir, efficaces en botanique et en minéralogie, étaient peu efficaces en biologie animale, l’intensité de cette fluorescence directe étant trop faible et la coloration peu sélective. Un meilleur rendement est obtenu en traitant les préparations par des solutions fortement diluées de colorants organiques particuliers, des fluorochromes, ne lésant pas les tissus. Cette fluorescence secondaire, introduite par Haitinger, permet aux constituants de la préparation d’émettre des rayonnements fluorescents dans des bandes spectrales les caractérisant. De plus, selon la longueur d’onde excitatrice et le fluorochrome choisi, ces bandes sont spécifiques et permettent de caractériser la substance examinée et son état pathologique.
 Fig. 7 |
L’emploi d’une lampe à arc de forte puissance (fig. 7) SUV émettant de courtes longueurs d’onde permet d’exciter la fluorescence, la bande spectrale excitatrice étant sélectionnée par le filtre d’excitation FE. L’image des zones fluorescentes de l’objet AB est formée par l’objectif en lumière du spectre de fluorescence, la lumière excitatrice beaucoup plus intense étant bloquée par le filtre d’arrêt FA. Un éclairage en fond clair par la source SB peut être superposé pour former une image entière de la préparation afin de localiser les zones fluorescentes. En cas de trop faible rendement de l’excitation, on préfère associer un éclairage en contraste de phase ou en fond noir. Un condenseur de forte ouverture numérique transparent en ultraviolet et si nécessaire un liquide d’immersion non fluorescent (glycérine) doivent être utilisés. Pour améliorer le rendement, la fluorescence étant émise dans toutes les directions, son excitation tend à se faire à l’aide d’un rayonnement transmis par l’objectif (épifluorescence).
Microscopies optoacoustique et photothermique
Si une onde lumineuse focalisée sur un objet solide est modulée en intensité, celui-ci est soumis à un chauffage périodique résultant de l’absorption de la lumière. Il se crée alors une onde thermique à sa surface. Entraînant alternativement des dilatations et des contractions dans la structure du matériau, elle donne naissance à une onde acoustique. Ces deux ondes, tant thermique qu’acoustique, de même période que la modulation optique, sont susceptibles de fournir des informations sur les propriétés thermiques ou mécaniques du matériau. Cette procédure, associée à un balayage de l’objet, constitue l’imagerie photothermique ou optoacoustique (encore appelée photoacoustique).
 Fig. 8 |
Pratiquement (fig. 8), l’onde lumineuse issue d’un laser L, modulée en intensité à l’aide d’un modulateur Mod et défléchie dans deux directions par un déflecteur Déf est focalisée sur l’objet A par le microscope M. Le récepteur R, détecteur thermique infrarouge ou microphone, fournit un signal modulé à la même fréquence que l’onde lumineuse. Après traitement, ses informations peuvent être affichées sur un récepteur de télévision TV sous forme d’une image thermique ou acoustique.
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